Inmunodotting

Inmuno dotting para hepatitis autoinmune.

(Auto-Ac contra M2/nPDC, M2 recombinante.)
18.12.19

Uso previsto

Alphadia liver Prodile Dot es un kit de inmunodoting destinado a la detección en suero humano de auto-Ac tipo Ig G/Ig M antimitocondriales dirigidos contra los siguientes Ag: M2/PDC nativo (subunidades E1, E2 y E3 del complejo Piruvato Deshidrogenasa) y M2 recombinante (mezcla de las subunidades E2 del complejo Oxoglutarato Deshidrogenasa ) y M2 recombinante (mezcla de subunidades E2 del complejo oxoglutarato Deshidrogenasa, de la cadena ramificada del complejo Deshidrogenasa Ácida y del complejo Piruvato Deshidrogenasa.

Principios de la prueba

La prueba se basa en el principio de Enzimoinmunoanálisis. Cada tira del test está compuesta por una membrana fijada sobre un soporte plástico; en dicha membrana se han dispensado directamente los distintos Ag anteriormente mencionados. Durante el desarrollo de la prueba, las tiras se incuban con suero diluido de los pacientes. Si dichos sueros contienen los auto-Ac buscados, se unirán específicamente al correspondiente Ag de los fijados en la membrana. Mediante un lavado eliminaremos el exceso de Ac que no se han unido a sus Ag para, posteriormente, añadir un conjugado de origen caprino marcado con ALP; dicho conjugado va dirigido contra la Ig G humana. El conjugado se une a los complejos Ag-Ac. Después de realizar un segundi lavado con el fin de eliminar el exceso de conjugado se añade el sustrato que, por accción de la enzima ALP, desarrollará una coloración púrpura en el lugar correspondiente de la membrana. Dicha coloración tendrá una intensidad directamente proporcional a la cantidad de Ac presente en la muestra.

Contenido en el kit.

1. Para ser diluido:

• Tapón de lavado concentrado 10x: tapón incoloro.

2. Listo para usar:

• Tiras dot: 24 unidades
• Tampón diluido (1x40 ml): tapón amarillo
• Conjugado ( 1x40ml): Tapón rojo
• Sustrato (1x40ml) Bote marrón
• Bandejas de incubación: 3 unidades.

Procedimiento

1. Colocamos una tira por paciente en un canal de la bandeja de incubación con los puntos azules mirando hacia arriba.

2. Añadimos 2ml de tampón de lavado en cada canal usado. Incubar 10min en agitación. Podremos observar los puntos azules de la tira desaparecer por completo; si no es así continuar con el procedimiento hasta que lo hagan.

3.Eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secamos el borde de la bandeja con papel absorbente.

4. Añadimos 1,5ml de tampón de dilución en cada uno de los canales utilizados 

5. Añadir 10 ul de muestra del paciente por canal. Incubar 30 min en agitación. Evitamos tocar la membrana con las puntas de las pipetas. La muestra se debe dispersar sobre la parte superior de la tira (zona de la etiqueta de plástico)

6. Eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secamos el borde de la bandeja con papel absorbente.

7. Lavar tres veces cada canal utilizado (durante 3 min cada vez) con 1.5 ml de tampón de lavado. Agitamos durante el lavado. Después de cada lavado eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.  invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secamos el borde de la bandeja con papel absorbente.

8. Añadimos 1.5 ml de conjugado por canal utilizado e incubamos durante 30 min en agitación.

9. Eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.  invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secamos el borde de la bandeja con papel absorbente.

10. Lavamos dos veces cada canal utilizado (durante 3 min cada vez) con 1.5 ml de tampón de lavado. Agitamos durante el lavado. Después de cada lavado eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.  invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secamos el borde de la bandeja con papel absorbente.

11.  Añadimos 1.5 ml de sustrato por canal utilizado e incubamos durante 30 min en agitación.

12. Eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.  invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secamos el borde de la bandeja con papel absorbente.

13. Lavar una vez más (durante 3 min ) con 1.5ml de tampón de lavado para detener la reacción 

14. Extraer las tiras de los canales y dejarlas secar en papel absorbente.

Interpretación de resultados

1. Despegamos la cubierta del adhesivo en la parte posterior de cada tira y colocamos dichas tiras con los puntos boca arriba junto a la hoja de interpretación proporcionada en el kit. Este indicará las posiciones respectivas de los diferentes controles y antígenos de la muestra

2. El punto superior, control positivo, debe aparecer coloreado en todos los pacientes.

3. En condiciones óptimas, y si la muestra está libre de sustancias que interfieran, el control negativo será incolor, esto indica la existencia de uniones inespecíoficas debidas a las sustancias con capacidad de interferir y que están presentes en la muestra.

4.Resultado negativo 

Triglicéridos

Práctica 14

Determinación cuantitaviva de triglicéridos

Principio del método

Los triglicéridos incubados con lipoproteínas (LPL), liberan glicerol y ácidos grasos libres. El glicerol es fosforilado por glicerolfosfato deshidrogenasa (GPO) y ATP rn presencia de glicerol quinasa (GK) para producir glicerol quinasa (GK) para producir glicerol-3-fosfato (G3P) y adenosina-5-difosfato (ADP). El G3P es entonces covertido a dehidroxicetona fosfato (DAP) y peróxido de hidrogeno (H2O2) por GPO.

Al final, el peróxido de hidrógeno reacciona con 4-aminotenazona (4AF) y p-clorofenol, reacción cataliada por la peroxidasa (POD) dando una coloración roja.
Intensidad del color formado es proporcional a la concentración de triglicéridos presentes en la mjuestra ensayada.

Significado clínico

Los triglicéridos son grasas que suministran energía a la célula.
Al igual que el coleserol, son transportados a las células del organismo por las lipoproteínas en la sangre.

Una diesta alta en grasas saturadas o carbohidratos puede elevar los niveles de triglicéridos.

Su aumento es relativamente inespecífico. Diversas dolencias, como ciertas difunciones hepáticas (cirrosis, hepatitis, obstrucción biliar) o diabetes mellitus, pueden estar asociadas a su elevación.

Reactivos

• R1- Tampón 
• R2- Enzimas
• Calibrador de Triglicéridos.

Preparación 

El grupo uno preparó el reactivo de trabajo (RT) vaciando las enzimas del R2 en el frasco de R1 tampón.

Conservación y estabilidad

Hata la fecha de caducidad, conservar 2-8ºC protegidos de la luz

Material adicional

• Espectofotómetro
• Cubetas de 1 cm de paso de luz
• Equipamiento habitual de laboratorio.

Muestra

Suero y plasma heparinizado o EDTA.

Procedimiento:

1. Preparamos las condiciones de ensayo:

• Longitud de onda: 505 nm
• Cubeta: 1 cm paso de luz                                                                                  
• Temperatura: 37ºC/15-25ºC

2. Ajustamos el espectofotómetro a 0 frente a agua destilada
y pipeteamos en una cubeta:

 

 

3. Mezclar e incubar 5 min a 37ºC.

4. Leemos la absorbancia del patrón: 0.288 y la muestra: 0.262, frente al blanco de reactivo.

Cálculos

(0.262/0.288) x 200 = 181.94
Un poco más alto que los valores de referencia.
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                   

Hemoglobina glicosilada Alc-PRONTO

Practica 13

Determinación cromatográfica-espectofotómétrica de la Hb Alc en sangre.

Método de intercambio iónico independiente de la temperatura. 12.12.19

Objetivo

Determinación cuantitativa in vitro de la hemoglobina ALc en sangre.

Utilidad clínica:

Observar si el porcentaje del resultado esta dentro del rango normal.

Fundamento

Mezclando una alícuota de sangre completa con un agente hemolizante, se obtiene la lisis de los hematíes, la liberación de la hemoglobina contenida en ellos y la eliminación de la fracción lábil. La fracción Alc de la hemoglobina glucosilada es separada de la Hb AlA+B mediante cromatografía de intercambio catiónico.

El porcentaje de Hb Alc se contiene por comparación de la absorbancia (a 415nm) del eluído con la absorbancia de la hemoglobina total.

El porcentaje no requiere ninguna calibración y puede realizarse en un rango de temperaturas de 20 a 28ºC.

Reactivos y materiales

• Reactivo 1: bifalato de potasio.
• Reactivo 2: tampón 42mmol/l
• Reactivo 3: tampón 50mmol/l
• Columnas cromatográficas.
• Pipetas 20-100 ul
• Pipetas de 1000ul
• Pipetas de 5000 ul
• Tubos de 16x160mm

Muestra:

• Sangre completa con EDTA.

Pocedimiento

1.Preparamos las condiciones de trabajo:

• Longitud de onda:415nm
• Paso de luz :1 cm
• Lectura: frente agua destilada.
• Temperatura: 20-28º

Preparación del hemolizado:

1.Pipeteamos en un tubo:

• 50ul de sangre
• 450ul del reactivo 1

2.Mezclamos vigorosamente e incubamos a temperatura ambiente durante 15min.

Separaciómn cromatográfica

1.Quitamos el tapón superior de la columna y rompemos la espita inferior para porder retirar así el líquido de su inteior.

2.Pipeteamos en el interior de la columna:

• 50ul de hemolizado y esperamos 3 min para descartar el eventual iluído.
• 2000ul de reactivo 2 y esperamos a que caíga todo el líquido para descartar el iluído

3.Colocamos la columna dentro de un tubo de 16x160mm y pipeteamos:

• 2000ul de reactivo 3 y una vez que haya caído todo el líquido cogemos el eluído (HbAlc)

4.Mezclamos el eluído obtenido y leemos la absorbancia de ña fracción Alc de la hemoglobina en las condiciones citadas anteriormente.

Cálculos:

(0.116(A HbAlc)/ 3 x 1.036 (A Hb Total)) x 100 =3.37%
NOTA: se multiplica por 3 porque esta diluido 3 veces.

• Según los valores de referencia es un poco bajo, pero en nuestro laboratorio es lo normal haciendo referencia  nuestros valores.

Cuantificación de proteínas

Práctica 11

Identificación y cuantificación de proteínas plasmáticas en suero. 27.11.19

Fundamento:

Las proteínas, moléculas anfóteras, en medio básico adquieren una carga global negativa que hace que migren del cátodo hacia el ánodo cuando son sometidas a un proceso electroforético.

Como consecuencias de esta migración, se obtienen habitualmente cinco fracciones correspondientes a diferentes proteínas plasmáticas con carga negativa decreciente:

• Albúmina.
• Alfa1-globulinas.
• Alfa2-globulinas.
• Beta-globulinas
• Gamma-globulinas

Material:

• Alimentador para la electroforesis

• Cubeta de electroforesis
• Aplicador (individual)

• Tiras de acetaro de celulosa.
• Láminas Mylar
• Papel de filtro.

Reactivos

• Solución tampón (Tris Hipurato)
• Colorante rojo Ponceau
• Decolorante rojo Ponceau (ácido cítrico o ácido acético al 5%)
• Solución transparentadora
• Solución disolvente (ácido acético al 80%)

Técnica

Una vez que hemos abierto el envase de tiras, debemos conservar los sobrenadantes en una solución de metanol al 30-40%

Usamos el buffer que usaron el año pasado.

Preparamos el decolorante preparando 1000 ml de disolución de ácido acético al 5% .

NOTA: el decolorante esta listo para usar cuando todo el material se ha disuelto y se ha mezclado completamente.

1.Equilibrado de las tiras:
Cada mesa introdujimos una tira en 100ml de buffer.

2.Preparamos la cámara de electroforesis, llenandola completamente con el tampón.

3. Seleccionamos la muestra que vamos a usar: suero

4. Secamos las tiras colocandolas entre dos hojas de papel de filtro para retirar el exceso del tampón.

5. Colocamos las tiras en el puente y aplicamos el suero.
Se colocan con la cara absorbente hacia abajo (el borde cuadrtado en la esquina inferior derecha o en la esquina superior izquierda). Colocamos el puente en la cámara de electroforesis. Aplicamos la mjuestra en la tira, utilizando el aplicador, durante 10 segundos.
NOTA: La aplicación se hace a 2 cm del borde situado más cerca del polo negativo.

6. Conectamos la fuente de alimentación a 200 v durante 35 min

7. Sumergimos la tira en colorante rojo Ponceu durante 5 min mientras que agitamos la cubeta constantemente.

8. Decoloramos la tira. Sumerguimos la tira en la solución de ácido cítrico
NOTA: Hicimos dos baños para conseguir que todas las tiras se quedaran lo más transparentes posibles
Aquí tambien moveremos la cubeta.

9.Al finalizar el proceso de decoloración, sumergimos las tiras en líquido trasparentador durante un minuto, agitando la cubeta. Colocamos la tira sobre la superficie Mylar film y eliminamos el exceso de líquido transparentador con un rodillo. Calentamos la tira a 80ºC en una estufa durante 10 min.

Una vez pasado el tiempo tenemos que dejar que la tira b¡vuelva a su temperatura ambiente (nos esperamos hasta la siguientes clases de bioquímica). Colocamos las tiras en el fotodensitómetro a 520 nm 

Inmunodifusión radial

Práctica 10 

Cuantificación de las proteínas por inmunodifusión radial. 4.12.12

Objetivo del experimento:

La inmunodifusión radial es una técnica cuantitativa muy sensible que se utiliza a menudo para detectar los niveles de determinadas proteínas sanguíneas a los pacientes. En esta práctica, vamos a determinar cuantitativamente una concentración desconcida de una proteína.

Materiales y reactivos

• Agua destilada
• Componente D - Buffer
• Componente C - agarosa
• Componente C - anticuerpos
• Solución de antígenos estándar
• Solución de antígenos desconocido
• Pipetas pasteur
• Pipetas y puntas
• Placas pequeñas
• Matraces y probetas.

Preparación del tampón 

La mesa 4 se encargó de preparar el de toda la clase:
Con 200 ml de agua destilada y un sobre del componente D

De aquí se reserva 50 ml 

Preparación de placas de agarosa:

Mi mesa fue la encargada de llevarlo a cabo:
Cogimos 150 ml de tampón y un sobre del componente C

Mezclamos y lo metemos en el microondas (hasta que vemos que empieza a hervir)

Una vez que estaba transparente lo metemos en el baño termostáctico a 50ºC para enfriar 

Se coge 26 ml de la agarosa líquida y se le añade el componente A
Finalmente añadimos 2.5 ml en cada placa y dejamos que se enfrie hasta solidificar.
NOTA: una vez echada la agarosa líquida la placa se debe mover lo menos posible.

Cada grupo:

Debemos preparar:

• 1 tubo E con 75 ul de solución Ag estándar
• 1 tubo D con 10 ul de solución Ag desconocido
• 1 tubo T con 1 ml de tampón

• Batería de dilución:

1 tubo 1:2 con 50 ul de tampón y 50 ul del tubo E
1 tubo 1:4 con 50 ul de tampón y 50 ul del tubo 1:2
1 tubo 1:8 con 50 ul de tampón y 50 ul del tubo 1:4
1 tubo 1:16 con 50 ul de tampón y 50 ul del tubo 1:8

5TUBOS - E/1:2/1:4/1:8/1:16

Perforar pocillos

Primero lo intetamos con una pajita, pero la placa era demasiado pequeña y no salía del todo bien así que decidimos hacerlo con pipetas pasteur.

Cargar patrones/muestra:

5 ul de cada tubo en los pocillos perifericos y 5 ul de tubo D en pocillo central

Por último lo metemos en una cámara húmeda durante >48 horas, en nuestro caso van a ser 5 días.

Lectura de los resultados:

Con una regla medimos el diámetro del anillo de precipitación en milímetros. Elevamos al cuadrado el valor del diámetro: