Hemoglobina glicosilada Alc-PRONTO

Practica 13

Determinación cromatográfica-espectofotómétrica de la Hb Alc en sangre.

Método de intercambio iónico independiente de la temperatura. 12.12.19

Objetivo

Determinación cuantitativa in vitro de la hemoglobina ALc en sangre.

Utilidad clínica:

Observar si el porcentaje del resultado esta dentro del rango normal.

Fundamento

Mezclando una alícuota de sangre completa con un agente hemolizante, se obtiene la lisis de los hematíes, la liberación de la hemoglobina contenida en ellos y la eliminación de la fracción lábil. La fracción Alc de la hemoglobina glucosilada es separada de la Hb AlA+B mediante cromatografía de intercambio catiónico.

El porcentaje de Hb Alc se contiene por comparación de la absorbancia (a 415nm) del eluído con la absorbancia de la hemoglobina total.

El porcentaje no requiere ninguna calibración y puede realizarse en un rango de temperaturas de 20 a 28ºC.

Reactivos y materiales

• Reactivo 1: bifalato de potasio.
• Reactivo 2: tampón 42mmol/l
• Reactivo 3: tampón 50mmol/l
• Columnas cromatográficas.
• Pipetas 20-100 ul
• Pipetas de 1000ul
• Pipetas de 5000 ul
• Tubos de 16x160mm

Muestra:

• Sangre completa con EDTA.

Pocedimiento

1.Preparamos las condiciones de trabajo:

• Longitud de onda:415nm
• Paso de luz :1 cm
• Lectura: frente agua destilada.
• Temperatura: 20-28º

Preparación del hemolizado:

1.Pipeteamos en un tubo:

• 50ul de sangre
• 450ul del reactivo 1

2.Mezclamos vigorosamente e incubamos a temperatura ambiente durante 15min.

Separaciómn cromatográfica

1.Quitamos el tapón superior de la columna y rompemos la espita inferior para porder retirar así el líquido de su inteior.

2.Pipeteamos en el interior de la columna:

• 50ul de hemolizado y esperamos 3 min para descartar el eventual iluído.
• 2000ul de reactivo 2 y esperamos a que caíga todo el líquido para descartar el iluído

3.Colocamos la columna dentro de un tubo de 16x160mm y pipeteamos:

• 2000ul de reactivo 3 y una vez que haya caído todo el líquido cogemos el eluído (HbAlc)

4.Mezclamos el eluído obtenido y leemos la absorbancia de ña fracción Alc de la hemoglobina en las condiciones citadas anteriormente.

Cálculos:

(0.116(A HbAlc)/ 3 x 1.036 (A Hb Total)) x 100 =3.37%
NOTA: se multiplica por 3 porque esta diluido 3 veces.

• Según los valores de referencia es un poco bajo, pero en nuestro laboratorio es lo normal haciendo referencia  nuestros valores.