Inmunodifusión radial

Práctica 10 

Cuantificación de las proteínas por inmunodifusión radial. 4.12.12

Objetivo del experimento:

La inmunodifusión radial es una técnica cuantitativa muy sensible que se utiliza a menudo para detectar los niveles de determinadas proteínas sanguíneas a los pacientes. En esta práctica, vamos a determinar cuantitativamente una concentración desconcida de una proteína.

Materiales y reactivos

• Agua destilada
• Componente D - Buffer
• Componente C - agarosa
• Componente C - anticuerpos
• Solución de antígenos estándar
• Solución de antígenos desconocido
• Pipetas pasteur
• Pipetas y puntas
• Placas pequeñas
• Matraces y probetas.

Preparación del tampón 

La mesa 4 se encargó de preparar el de toda la clase:
Con 200 ml de agua destilada y un sobre del componente D

De aquí se reserva 50 ml 

Preparación de placas de agarosa:

Mi mesa fue la encargada de llevarlo a cabo:
Cogimos 150 ml de tampón y un sobre del componente C

Mezclamos y lo metemos en el microondas (hasta que vemos que empieza a hervir)

Una vez que estaba transparente lo metemos en el baño termostáctico a 50ºC para enfriar 

Se coge 26 ml de la agarosa líquida y se le añade el componente A
Finalmente añadimos 2.5 ml en cada placa y dejamos que se enfrie hasta solidificar.
NOTA: una vez echada la agarosa líquida la placa se debe mover lo menos posible.

Cada grupo:

Debemos preparar:

• 1 tubo E con 75 ul de solución Ag estándar
• 1 tubo D con 10 ul de solución Ag desconocido
• 1 tubo T con 1 ml de tampón

• Batería de dilución:

1 tubo 1:2 con 50 ul de tampón y 50 ul del tubo E
1 tubo 1:4 con 50 ul de tampón y 50 ul del tubo 1:2
1 tubo 1:8 con 50 ul de tampón y 50 ul del tubo 1:4
1 tubo 1:16 con 50 ul de tampón y 50 ul del tubo 1:8

5TUBOS - E/1:2/1:4/1:8/1:16

Perforar pocillos

Primero lo intetamos con una pajita, pero la placa era demasiado pequeña y no salía del todo bien así que decidimos hacerlo con pipetas pasteur.

Cargar patrones/muestra:

5 ul de cada tubo en los pocillos perifericos y 5 ul de tubo D en pocillo central

Por último lo metemos en una cámara húmeda durante >48 horas, en nuestro caso van a ser 5 días.

Lectura de los resultados:

Con una regla medimos el diámetro del anillo de precipitación en milímetros. Elevamos al cuadrado el valor del diámetro: