Inmunodotting

Inmuno dotting para hepatitis autoinmune.

(Auto-Ac contra M2/nPDC, M2 recombinante.)
18.12.19

Uso previsto

Alphadia liver Prodile Dot es un kit de inmunodoting destinado a la detección en suero humano de auto-Ac tipo Ig G/Ig M antimitocondriales dirigidos contra los siguientes Ag: M2/PDC nativo (subunidades E1, E2 y E3 del complejo Piruvato Deshidrogenasa) y M2 recombinante (mezcla de las subunidades E2 del complejo Oxoglutarato Deshidrogenasa ) y M2 recombinante (mezcla de subunidades E2 del complejo oxoglutarato Deshidrogenasa, de la cadena ramificada del complejo Deshidrogenasa Ácida y del complejo Piruvato Deshidrogenasa.

Principios de la prueba

La prueba se basa en el principio de Enzimoinmunoanálisis. Cada tira del test está compuesta por una membrana fijada sobre un soporte plástico; en dicha membrana se han dispensado directamente los distintos Ag anteriormente mencionados. Durante el desarrollo de la prueba, las tiras se incuban con suero diluido de los pacientes. Si dichos sueros contienen los auto-Ac buscados, se unirán específicamente al correspondiente Ag de los fijados en la membrana. Mediante un lavado eliminaremos el exceso de Ac que no se han unido a sus Ag para, posteriormente, añadir un conjugado de origen caprino marcado con ALP; dicho conjugado va dirigido contra la Ig G humana. El conjugado se une a los complejos Ag-Ac. Después de realizar un segundi lavado con el fin de eliminar el exceso de conjugado se añade el sustrato que, por accción de la enzima ALP, desarrollará una coloración púrpura en el lugar correspondiente de la membrana. Dicha coloración tendrá una intensidad directamente proporcional a la cantidad de Ac presente en la muestra.

Contenido en el kit.

1. Para ser diluido:

• Tapón de lavado concentrado 10x: tapón incoloro.

2. Listo para usar:

• Tiras dot: 24 unidades
• Tampón diluido (1x40 ml): tapón amarillo
• Conjugado ( 1x40ml): Tapón rojo
• Sustrato (1x40ml) Bote marrón
• Bandejas de incubación: 3 unidades.

Procedimiento

1. Colocamos una tira por paciente en un canal de la bandeja de incubación con los puntos azules mirando hacia arriba.

2. Añadimos 2ml de tampón de lavado en cada canal usado. Incubar 10min en agitación. Podremos observar los puntos azules de la tira desaparecer por completo; si no es así continuar con el procedimiento hasta que lo hagan.

3.Eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secamos el borde de la bandeja con papel absorbente.

4. Añadimos 1,5ml de tampón de dilución en cada uno de los canales utilizados 

5. Añadir 10 ul de muestra del paciente por canal. Incubar 30 min en agitación. Evitamos tocar la membrana con las puntas de las pipetas. La muestra se debe dispersar sobre la parte superior de la tira (zona de la etiqueta de plástico)

6. Eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secamos el borde de la bandeja con papel absorbente.

7. Lavar tres veces cada canal utilizado (durante 3 min cada vez) con 1.5 ml de tampón de lavado. Agitamos durante el lavado. Después de cada lavado eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.  invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secamos el borde de la bandeja con papel absorbente.

8. Añadimos 1.5 ml de conjugado por canal utilizado e incubamos durante 30 min en agitación.

9. Eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.  invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secamos el borde de la bandeja con papel absorbente.

10. Lavamos dos veces cada canal utilizado (durante 3 min cada vez) con 1.5 ml de tampón de lavado. Agitamos durante el lavado. Después de cada lavado eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.  invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secamos el borde de la bandeja con papel absorbente.

11.  Añadimos 1.5 ml de sustrato por canal utilizado e incubamos durante 30 min en agitación.

12. Eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.  invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secamos el borde de la bandeja con papel absorbente.

13. Lavar una vez más (durante 3 min ) con 1.5ml de tampón de lavado para detener la reacción 

14. Extraer las tiras de los canales y dejarlas secar en papel absorbente.

Interpretación de resultados

1. Despegamos la cubierta del adhesivo en la parte posterior de cada tira y colocamos dichas tiras con los puntos boca arriba junto a la hoja de interpretación proporcionada en el kit. Este indicará las posiciones respectivas de los diferentes controles y antígenos de la muestra

2. El punto superior, control positivo, debe aparecer coloreado en todos los pacientes.

3. En condiciones óptimas, y si la muestra está libre de sustancias que interfieran, el control negativo será incolor, esto indica la existencia de uniones inespecíoficas debidas a las sustancias con capacidad de interferir y que están presentes en la muestra.

4.Resultado negativo