MEDICIÓN DE LA HEMOGLOBINA

PRÁCTICA 9 - Medición de Hemoglobina Glicosilada (HbA1c)

OBJETIVO:

La prueba de la hemoglobina glicosilada (HbA1c) es un examen de sangre para la diabetes tipo II y la prediabetes.Mide el nivel promedio de glucosa en sangre durante los últimos 3 meses.Los facultativos pueden usar la prueba HbA1c sola o en combinación con otras pruebas de diabetes para hacer un diagnóstico.La HbA1c también es utilizada para comprobar el control que sigue el paciente diabético sobre sus niveles de glucosa/insulina.

MATERIALES:

• Micropipetas de 5 y 25 μL.
• R1 → solución tampón de glicinamida que contiene ácido bórico conjugado con un colorante y detergentes (reactivo).
• R2 → solución de NaCl tamponada a la morfolina y detergentes (solución de lavado).
• Muestra → sangre anticoagulada con EDTA.
• Puntas de pipeta
• Disco con membrana (TD/Dispositivo-test)
• NycoCard READER II

Lectura con el aparato NycoCard READER II

1.Se realiza el blanco de la muestra, para ello el equipo consta de un disco con membrana sin muestra integrado.

2.Se coge el lápiz de lectura.

3.Se coloca la punta del lápiz en la membrana del disco y se baja el diafragma que tiene integrado el lápiz.

NOTA: la bajada del diafragma debe realizarse rápidamente para no falsear los resultados.

4. Se lee la medida en la pantalla del aparato.

PROCEDIMIENTO

1. Añadir 5 μL de sangre completa en el tubo de ensayo prellenado con el R1 (reactivo).

2. Mezclar bien y dejar reposar durante 2-3 minutos.

NOTA: el tiempo no debe ser menos a 2 minutos, ni mayor a 3 minutos.

3. Mezclar nuevamente con el fin de obtener una suspensión homogénea.

4. Depositar 25 μL de la mezcla sobre el TD/Dispositivo-test manteniendo la micropipeta separada al menos 0.6 cm de la placa del testo.

NOTA: evitar la formación de burbujas de aire.

5. Dejar penetrar completamente la mezcla reactiva en la membrana del dispositivo.

6. Esperar un mínimo de 10 segundos.

7. Añadir 25 μL de la R2 (solución de lavado) sobre la palca dispositivo.

8. Dejar penetrar la solución de lavado completamente sobre la membrana.

9. Esperar un mínimo de 10 segundos.

NOTA: evitar la formación de burbujas de aire.

10. Leer el resultado dentro de los 5 minutos siguientes utilizando NycoCard READER II.

RESULTADO

El resultado de la medición fue de 9.8%, un valor un poco bajo respecto a los valores de referencia.

Método Biuret

PRACTICA 8 - Determinación de proteínas totales por el método de Biuret. 18.11.19

OBJETIVO:

Proporcionar a la concentración de proteínas totales en la muestra ensayada

UTILIDAD CLÍNICA

Las proteínas son compuestos orgánicos macromoleculares ampliamente distribuidos en el organismo. Actúan como elementos estructurales de transporte. Se dividen en dos fracciones, albúmina y globulinas.

Su determinación es útil en la detección de:

• Hiperproteína producida por hemoconcentración, deshidratación o aumento en la concentración de poteínas específicas.
• Hipoproteinemia por hemodilución debida a un defecto en la síntesis proteica, perdidas excesivas (hemorragias) o catabolismo proteico excesivo.

El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio

REACTIVOS:

• Reactivo Biuret
• T protein cal

MATERIAL ADICIONAL:

• Espectofotómetro 
• Cubetas
• Equipamiento habitual de laboratorio

MUESTRAS:

• Suero

PROCEDIMIENTO:

1. Condiciones de ensayo: longitud de onda 540nm, cubetas 1cm de paso de luz y a temperatura ambiente.

2.Ajustar el espectofotómetro frentre a agua destilada.

3. Pipeteamos en un tubo:

4. Mezclamos y esperamos 10 min a Tª ambiente

5. Leemos la absorbancia de patrón=0.529; y la muestra= 0.336

Cálculos:

Refractómetro

PRACTICA 7 - USO DEL REFRACTÓMETRO. 31.10.19

Con el uso de una gota de suero y el refractómetro conseguimos calcular la densidad del suero (1.3500) y concentración de proteínas (7.5 g/dl)

Cromatrografía.

PRACTICA 6 - SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA. 24.10.19 

OBJETIVO:

Realizar una separación e identificación de los aminoácidos triptófano, alanina, valina y arginina presentes en una muestra meidante una cromatografía de capa fina ascendente.

MATERIAL:

• Láminas de gel de celulosa
• Disolvente de cromatografía
• Disolución reveladora: Resuspender nihindirnaen acetona a una concentración de 0.2% (p/v)

• Muestra problema conteniendo una mezca desconocida de aminoácidos.
• Muestra patrón de aminoácidos
• cubeta o tarro de cristal
• Micropipeta
• Atomizador

Procedimiento

1. Colocamos el disolvente en un vaso de precipitados de forma que cubra el fondo hasta una altura máxima de 1cm y cerrarla.

2. Coger una placa de gel de celulosa y con un lápiz muy blando, para no dañar el gel, marcar los límites de la placa (5 x 10cm)

Nota:para la placa usar guantes y coger por los bordes ya que la huella de los dedos podrían aparecer posteriormente como confusas manchas coloreadas.

3. Con el mismo lápiz marcar los puntos donde se aplicaran las muestras. A 1.5cm de la base y separados entre si 1cm. Con la placa en posición horizontal aplicamos 2ul de la muestra y patrones de aminoácidos apoyando suavemente la punta de la micropipeta sobre el punto señalado en la celulosa. Se aplica y se seca varias veces, para evitar una excesiva superficie del punto de aplicación.

4. Cuando las manchas se secan, introducimos la placa verticalemnte en la cubeta de forma que la muestra quede en la base de la cubeta y asegurandonos de que los puntos de aplicación se quedan por encima de del nivel de disolvente.Poner la tapa y dejar que el disolvente suba por capilaridad durante media hora o una hora.

5. Cuando el frente haya subido aproximadamente 8 cm sacar la placa del vaso, marcar con el lápiz el frente del disolvente y secar en estufa.

6. Con la placa perfectamente seca y en posición vertical, pulverizar con el revelador de nlnhidrina. La pulverización debe hacerse suave y uniforme.

7.Calentamos la placa 2 min a 105ºC  en una estufa.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En cada patrón de aminoácidos obtendremos una mancha característica. En la mezcla problema, obtendremos tantas manchas como aminoácidos existan en ella. La posición de los patrones nos ayudará a identificar los aminoácidos de la muestra:

1. Arguinina-- Rf =0.3
2. Ácido glutamínico - Rf = 0.73
3. Fenilananina - Rf =0.86