Cuantificación de proteínas

Práctica 11

Identificación y cuantificación de proteínas plasmáticas en suero. 27.11.19

Fundamento:

Las proteínas, moléculas anfóteras, en medio básico adquieren una carga global negativa que hace que migren del cátodo hacia el ánodo cuando son sometidas a un proceso electroforético.

Como consecuencias de esta migración, se obtienen habitualmente cinco fracciones correspondientes a diferentes proteínas plasmáticas con carga negativa decreciente:

• Albúmina.
• Alfa1-globulinas.
• Alfa2-globulinas.
• Beta-globulinas
• Gamma-globulinas

Material:

• Alimentador para la electroforesis

• Cubeta de electroforesis
• Aplicador (individual)

• Tiras de acetaro de celulosa.
• Láminas Mylar
• Papel de filtro.

Reactivos

• Solución tampón (Tris Hipurato)
• Colorante rojo Ponceau
• Decolorante rojo Ponceau (ácido cítrico o ácido acético al 5%)
• Solución transparentadora
• Solución disolvente (ácido acético al 80%)

Técnica

Una vez que hemos abierto el envase de tiras, debemos conservar los sobrenadantes en una solución de metanol al 30-40%

Usamos el buffer que usaron el año pasado.

Preparamos el decolorante preparando 1000 ml de disolución de ácido acético al 5% .

NOTA: el decolorante esta listo para usar cuando todo el material se ha disuelto y se ha mezclado completamente.

1.Equilibrado de las tiras:
Cada mesa introdujimos una tira en 100ml de buffer.

2.Preparamos la cámara de electroforesis, llenandola completamente con el tampón.

3. Seleccionamos la muestra que vamos a usar: suero

4. Secamos las tiras colocandolas entre dos hojas de papel de filtro para retirar el exceso del tampón.

5. Colocamos las tiras en el puente y aplicamos el suero.
Se colocan con la cara absorbente hacia abajo (el borde cuadrtado en la esquina inferior derecha o en la esquina superior izquierda). Colocamos el puente en la cámara de electroforesis. Aplicamos la mjuestra en la tira, utilizando el aplicador, durante 10 segundos.
NOTA: La aplicación se hace a 2 cm del borde situado más cerca del polo negativo.

6. Conectamos la fuente de alimentación a 200 v durante 35 min

7. Sumergimos la tira en colorante rojo Ponceu durante 5 min mientras que agitamos la cubeta constantemente.

8. Decoloramos la tira. Sumerguimos la tira en la solución de ácido cítrico
NOTA: Hicimos dos baños para conseguir que todas las tiras se quedaran lo más transparentes posibles
Aquí tambien moveremos la cubeta.

9.Al finalizar el proceso de decoloración, sumergimos las tiras en líquido trasparentador durante un minuto, agitando la cubeta. Colocamos la tira sobre la superficie Mylar film y eliminamos el exceso de líquido transparentador con un rodillo. Calentamos la tira a 80ºC en una estufa durante 10 min.

Una vez pasado el tiempo tenemos que dejar que la tira b¡vuelva a su temperatura ambiente (nos esperamos hasta la siguientes clases de bioquímica). Colocamos las tiras en el fotodensitómetro a 520 nm 

Inmunodifusión radial

Práctica 10 

Cuantificación de las proteínas por inmunodifusión radial. 4.12.12

Objetivo del experimento:

La inmunodifusión radial es una técnica cuantitativa muy sensible que se utiliza a menudo para detectar los niveles de determinadas proteínas sanguíneas a los pacientes. En esta práctica, vamos a determinar cuantitativamente una concentración desconcida de una proteína.

Materiales y reactivos

• Agua destilada
• Componente D - Buffer
• Componente C - agarosa
• Componente C - anticuerpos
• Solución de antígenos estándar
• Solución de antígenos desconocido
• Pipetas pasteur
• Pipetas y puntas
• Placas pequeñas
• Matraces y probetas.

Preparación del tampón 

La mesa 4 se encargó de preparar el de toda la clase:
Con 200 ml de agua destilada y un sobre del componente D

De aquí se reserva 50 ml 

Preparación de placas de agarosa:

Mi mesa fue la encargada de llevarlo a cabo:
Cogimos 150 ml de tampón y un sobre del componente C

Mezclamos y lo metemos en el microondas (hasta que vemos que empieza a hervir)

Una vez que estaba transparente lo metemos en el baño termostáctico a 50ºC para enfriar 

Se coge 26 ml de la agarosa líquida y se le añade el componente A
Finalmente añadimos 2.5 ml en cada placa y dejamos que se enfrie hasta solidificar.
NOTA: una vez echada la agarosa líquida la placa se debe mover lo menos posible.

Cada grupo:

Debemos preparar:

• 1 tubo E con 75 ul de solución Ag estándar
• 1 tubo D con 10 ul de solución Ag desconocido
• 1 tubo T con 1 ml de tampón

• Batería de dilución:

1 tubo 1:2 con 50 ul de tampón y 50 ul del tubo E
1 tubo 1:4 con 50 ul de tampón y 50 ul del tubo 1:2
1 tubo 1:8 con 50 ul de tampón y 50 ul del tubo 1:4
1 tubo 1:16 con 50 ul de tampón y 50 ul del tubo 1:8

5TUBOS - E/1:2/1:4/1:8/1:16

Perforar pocillos

Primero lo intetamos con una pajita, pero la placa era demasiado pequeña y no salía del todo bien así que decidimos hacerlo con pipetas pasteur.

Cargar patrones/muestra:

5 ul de cada tubo en los pocillos perifericos y 5 ul de tubo D en pocillo central

Por último lo metemos en una cámara húmeda durante >48 horas, en nuestro caso van a ser 5 días.

Lectura de los resultados:

Con una regla medimos el diámetro del anillo de precipitación en milímetros. Elevamos al cuadrado el valor del diámetro: